这样做ELISA检测结果更完美

这样做ELISA检测结果更完美

ELISA试剂盒检查体系可谓是免疫学反响应用到科研出产中最为广泛最为活络的技术手段。但是在新老手操作过程中总是会呈现或大或小的问题，比如说花板，假阳性，全显色，悉数显色，显色比空白还低.....

1、包被原的性质很重要，蛋白浓度，是不是降解，这联系到你做出的抗体可不能够被其辨认，所以保留抗原很重要，我做重组蛋白时，师兄都严厉正告我必定要在冰浴下缓慢消融即是这个道理。还有有的包被原也许不是蛋白，关于生物素和脂类物质或小分子物质咱们要事前对其改造再加以包被，办法扼要的列出如下:

①亲和素生物素:先亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被办法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。

②脂类物质:可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或凉风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相外表。

③小分子有必要依托和大的蛋白载体偶联后才干固定在固相载体上。

2、包被液的挑选，一般挑选ph9.6的碳酸盐缓冲液。但有时由于实验的需求，包被原的特殊性也也许选用中性的缓冲溶液来包。应留意以下原理：由于蛋白质与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸附联系的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体外表的疏水基团间的作用，这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响，大分子蛋白质较小分子蛋白质一般富含更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体外表。详细的实验还要有巩固的理论外也要实习，看一下终究可不能够应用到自己实验当中去。常用的包被液除了方才说到的pH9.6碳酸盐缓冲液，还有pH7.2的磷酸盐缓冲液和pH7-8的Tris-HCL缓冲液等等。

3、关闭：ELISA试剂盒继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。关闭即是让很多不相关的蛋白质充填这些空地，然后排挤ELISA后的过程中搅扰物质的再吸附。常用关闭剂有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉，比较价廉，能够高浓度使用(5%-10%);还有一些稀有用到的各种动物血清(主要为了扫除类似蛋白搅扰)和酪蛋白等等。但终究选用啥，要依据实验详细来实习。

4、洗刷板：能够说在ELISA操作中，洗刷是最主要的关键技术。由于聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，为到达别离游离的和联系的酶符号物的目的，铲除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的搅扰物质，在洗刷时又应把这种非特异性吸附的搅扰物质洗刷下来。所以在洗板时会有必定差错，人为因素很大(当然有条件的用洗板机在外)，洗的不完全或串了孔，对如此活络的ELISA体系但是不小的影响。

5、加抗体标本(和二抗):留意该换头时换头。标本稀释一般可用PBS稀释，也可用关闭液去稀释。如需加二抗，还要留意二抗的作业浓度，太低则上色浅。

6、显色：显色体系又很多，咱们一开始做的时分，要挑选适合的显色体系。留意显色体系酶活性底物的保留HRP联系物加硫柳泵，AP联系物可加叠氮钠。

7、ELISA试剂盒每次做尽量要把阴阳空三个对照做好，如呈现问题也罢剖析。